一种传统发酵彝药有效抑制新冠病毒的复制体外研究

　　摘要：目前，由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎（COVID-19）在全球大流行，已经导致8000多万人感染，170多万人死亡。疫情导致很多国家关闭了企业和学校，对全球经济造成严重破坏。目前，瑞德西韦已经被FDA批准用于新冠治疗，但是WHO宣称，瑞德西韦对新冠肺炎几乎无效。疫苗的研发取得了较大的进展，但安全有效的疫苗在临床上广泛使用，至少还需要数月的时间。临床研究发现，部分中药如莲花清瘟胶囊和藿香正气水等对新冠肺炎有较好的治疗作用。但目前为止，仍然没有治疗新冠肺炎的特效药。因而，急需发现能有效抗新冠病毒的药物。本研究对解本10号（一种传统彝药发酵技术生产的发酵液）的抗新冠活性进行研究。体外研究结果表明，解本10号能显著抑制SARS-CoV-2的复制，半数有效浓度EC50为稀释到发酵液的769.1倍，选择指数高达42.68。活性成分分析表明，解本10号中含有大量的超氧化物歧化酶（SOD）、黄酮、多酚、粗多糖等，这些活性成分可能是解本10号具有抗冠状病毒、抗炎、抗氧化等作用的主要原因。我们的研究为COVID-19提供了一种潜在的治疗策略。

　　关键词：新冠肺炎，新型冠状病毒SARS-CoV-2，抗病毒，传统彝药，发酵液。

　　研究背景

　　新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）是由新冠病毒SARS-CoV-2引起的急性呼吸道传染病。患者主要症状为发热，乏力，干咳，鼻塞，流涕等，上呼吸道感染症状较少见。约半数的患者在一周后可出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。SARS-CoV-2属于β属的冠状病毒,有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60-140nm。根据美国约翰·霍普金斯大学发布的新冠疫情最新统计数据，新冠病毒已经导致全球8000多万人感染，170多万人死亡。疫情导致很多国家关闭了企业和学校，对全球经济造成严重破坏。目前，瑞德西韦已经被FDA批准用于新冠治疗，但是WHO宣称，瑞德西韦对新冠肺炎几乎无效。疫苗的研发取得了较大的进展，但安全有效的疫苗在临床上广泛使用，至少还需要数月的时间。

　　目前，新冠疫情在中国已经很好地控制，在这个过程中，中医药做出了巨大贡献。如莲花清瘟胶囊和藿香正气水，能显著改善新冠引起的发烧、咳嗽、咳痰和呼吸困难等症状。然而，目前仍然没有治疗新冠的特效药。因此，发现能显著抑制新冠病毒复制的药物，对新冠疫情防控至关重要。

　　彝医药是中国传统医药的重要组成部分，对中华文明的发展做出了巨大贡献，其中世界著名的云南白药，就是来源于彝族医药。解本10号是一款基于传统彝族医药理论，用余甘子、刺梨、柠檬、核桃和蜂蜜共发酵得到的中药发酵液。前期，我们在筛选抗新冠病毒候选药物的过程中，发现了解本10号能显著抑制新冠病毒的复制。进一步的研究表明，解本10号具有良好的抗氧化和抗炎功效。本研究将为COVID-19提供了一种潜在的治疗策略。

　　结果

　　体外抗新冠病毒（SARS-CoV-2）活性研究

　　使用CCK-8试剂盒评价解本10号对Vero E6细胞的体外毒性作用。从图1可以看出，解本10号在浓度超过100倍稀释时，对Vero E6细胞没有明显毒性损伤。半数毒性浓度CC50为稀释18.02倍。根据以上结果，将解本10号稀释100倍以上，进行抗病毒活性实验室。实验步骤根据Wang等报道的方法略作修改，将Vero E6细胞以0.05的感染倍数（MOI）用SARS-CoV-2进行感染，然后用不同浓度的解本10号（稀释至100、200、400、800、1600和3200倍）下处理感染后的细胞，通过实时定量RT-PCR（qRT-PCR）检测细胞上清中病毒的拷贝数，评价病毒的复制情况。如图1所示，解本10号对SARS-CoV-2具有很强的抑制作用半数有效浓度EC50为稀释769.1倍，选择指数为42.68。这些结果表明解本10号具有开成为COVID-19治疗的候选药物的潜力。

（图1：解本10号对SARS-CoV-2的体外抑制活性）

将SARS-CoV-2以0.05的MOI感染Vero E6细胞，在不同剂量的解本10号发酵液中培养24 h，用qRT-PCR法测定细胞上清液中病毒含量。用CCK-8法测定解本10号发酵液对Vero E6细胞的毒性。

　　抗氧化活性研究

　　以活性氧（ROS）水平过高为特征的氧化应激在COVID-19的进展中起着至关重要的作用。许多证据表明，用抗氧化剂对ROS进行调节，可以防止COVID-19恶化。研究者们用二苯代苦味酰基自由基体系(DPPH·)和羟基自由基体系(·OH)对某解本10号的体外清除自由基能力进行了研究。如图2A所示，解本10号表现出非常强的DPPH自由基清除活性。当解本10号稀释至800倍、1600倍、6400倍和12800倍时，DPPH自由基去除率分别为82.99%、65.23%、53.09%和25.84%。从图2B可以看出，解本10号还表现出较强的羟自由基清除活性。稀释至20倍、30倍、40倍和50倍后，羟基自由基的去除率分别为67.42%、59.92%、53.91%和51.64%。

（图2 ：DPPH自由基和羟自由基的清除活性研究）

A. 解本10号稀释 800、1600、6400和12800倍

B. 解本10号稀释 20、30、40和 50倍

　　抗炎活性研究

　　细胞因子风暴和过度肺部炎症，是导致COVID-19感染者病情严重和死亡的重要原因。据报道，控制COVID-19的局部和全身炎症反应可能与抗病毒治疗一样重要。解本10号的抗炎活性根据Liu 等报道的方法进行测定。在抗炎实验开始前，用MTT法检测解本10号对RAW264.7细胞株的毒性。如图3A所示，解本发酵液稀释160倍以上，对RAW264.7细胞没有明显毒性。 用稀释500、1000、2000、4000、8000和16000倍的发酵液，处理LPS诱导的RAW264.7细胞，检测细胞分泌NO的情况，评价解本10号的抗炎活性。从图3B可以看出，解本10号可有效地抑制NO的产生。当解本10号稀释至2000倍时，NO抑制率仍接近80%。这些结果表明解本10号具有很强的抗炎活性。

（图3.：解本10号的抗炎活性）

A.解本10号对RAW 264.7细胞的毒性；B.解本10号抑制NO的生成

　　活性成分分析

　　由于解本10号具有较强的抗新冠病毒活性、抗氧化活性和抗炎活性，我们对其成分进行了分析，为解本10号的作用机制提供依据。由表1可知，解本10号含有维生素C、SOD、黄酮、多酚、粗多糖、原花青素、皂苷、香豆素等多种活性成分，而这些物质具有抗氧化、抗炎、调节免疫、抗病毒等作用。

　　讨论

　　中医药有近3000年的历史，在中国广泛应用。中国历史上发生过几次流行病，但幸运的是，没有发生大量伤亡，部分原因是使用了中医药。彝族传统医学是中医学的重要组成部分，有其独特的医学理论和实践经验。解本10号是以余甘子、刺梨、柠檬、核桃、蜂蜜为原料，按照彝族传统医学理论配伍，经发酵得到的发酵液。本文对解本10号抗新冠病毒SARS-CoV-2的活性进行了研究。我们发现解本10号具有显著的抗病毒活性。氧化应激和炎症在COVID-19的进展中起重要作用。因此，我们还探索了解本10号的抗炎和抗氧化活性。结果表明，解本10号具有较强的抗炎和抗氧化作用。

　　解本10号含有大量的维生素C、SOD、黄酮、多酚、粗多糖、原花青素、皂苷、香豆素等。维生素C具有抗病毒、抗氧化、抗炎、免疫调节等多种药理作用，是治疗COVID-19的一种潜在选择。SOD是一种活性很强的抗氧化剂，在对抗自由基损伤和炎症方面发挥着重要作用，此外SOD可能具有抗衰老作用。而衰老相关的炎症可能加重COVID-19。因此，SOD可能有利于COVID-19的治疗。研究表明，黄酮类化合物能抑制冠状病毒感染周期中的关键蛋白和SARS-CoV蛋白酶PLpro和3CLpro。黄酮类化合物对SARS-CoV的核苷三磷酸水解酶（NTPase）/解旋酶和N蛋白也有抑制作用。而解本10号中总黄酮含量高，这可能与我们观察到的病毒复制的抑制作用有关。多酚是自然界中一类重要的生物活性化合物，具有抗病毒和多种功效。研究表明，多酚被证明能抑制SARS-CoV-2融合/进入，破坏SARS-CoV-2复制，抑制宿主炎症反应。从表1可以看出，解本10号中的多酚含量丰富，这可能对解本10号的抗病毒活性有贡献。多糖具有良好的安全性、免疫调节性和抗病毒活性，在抗病毒尤其是抗冠状病毒方面有着广泛的应用。Song等人发现多糖对SARS-CoV-2具有很强的抑制活性。进一步的研究表明，多糖能与S糖蛋白结合，阻止SARS-CoV-2进入宿主细胞。Zhu等用SARS-Cov-2的主要蛋白酶（Mpro，3CLpro）筛选植物黄烷-3-醇和原花青素。结果表明，原花青素能抑制SARS-Cov-2的3CLpro活性。解本10号中高含量的原花青素也可能有助于抑制SARS-Cov-2的复制。计算机模拟研究表明，皂甙衍生物对SARS-CoV-2的类木瓜蛋白酶具有很高的结合亲和力。分子对接分析还表明，天然香豆素类似物飞龙掌血香豆醌对COVID-19的3CLpro有显著的抑制作用（与复合物α-酮酰胺相比（PDBID:5N5O）），结合能为-7.8kcal/mol。合成的香豆素类似物（1m）也表现出相当的抑制能力，COVID-19（含α-酮酰胺）与3CLpro的结合能为-7.1 kcal/mol。解本10号含有大量的香豆素，这可能有助于抑制病毒的复制。

　　总之，鉴于全球新冠肺炎流行的紧迫性，这种安全廉价的发酵液可能有助于预防或治疗COVID-19。我们的数据支持解本10号进入临床阶段，进一步验证其抗SARS-CoV-2感染和治疗的有效性。

　　材料和方法

　　材料

　　Vero E6细胞系和小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自ATCC。Vero E6细胞用高糖DMEM培养基（Gibco 41966-029）培养，培养基含10%（v/v）FBS、1%的青霉素和链霉素。RAW264.7细胞用DMEM培养，培养基含10%（v/v）FBS、1%的青霉素和链霉素。281 SARS-CoV-2毒株由深圳市疾病预防控制中心保存。用TCID50滴定法测定病毒滴度。解本10号发酵液，贵州金黔果生物科技有限公司提供，脂多糖（LPS）、MTT、硫酸亚铁和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）均购自西格玛奥德里奇，水杨酸购自百灵威科技有限公司，一氧化氮检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

　　体外抗病毒活性

　　Vero E6细胞以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板。将SARS-CoV-2以0.05的MOI感染细胞2h，用不同剂量的解本10号处理感染的细胞24h，用qRT-PCR法测定细胞上清液中病毒产量。解本10号对Vero E6细胞的细胞毒性通过CCK8试剂盒测定。将细胞接种于96孔板（5×103细胞/孔）中，培养过夜。解本10号用培养基稀释至10倍、20倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1600倍和3200倍，再与细胞孵育48小时，加入CCK8，再孵育4小时，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。实验至少重复3次。

　　抗氧化活性

　　采用DPPH自由基清除试验和羟自由基清除试验对解本10号的抗氧化活性进行评价。对于DPPH自由基清除试验，将200微升样品和2 ml 400μL DPPH溶液（溶解于70%乙醇溶液中）在室温下反应1 h。在517 nm处用含有DPPH和70%乙醇溶液的空白测量吸光度。DPPH自由基清除率（%）的计算公式如下：

　　其中，A0是空白对照的吸光度值，A是样品的吸光度值。

　　在羟自由基清除活性测定中，将250μL硫酸亚铁溶液（2 mM）、250μL水杨酸溶液（2 mM）和100μL样品充分混合。加入250微升过氧化氢溶液（0.01%），反应混合物在37℃搅拌30分钟。冷却后在510nm处测定吸光度。羟自由基清除率（%）按下式计算：

　　其中，Z0是空白对照的吸光度值，Zi是样品的吸光度值，Zi0是H2O2的吸光度值，不含显色剂。

　　抗炎活性

　　在抗炎活性实验开始前，检测解本10号对RAW264.7细胞株的细胞毒性。将RAW264.7接种到96孔板中。培养过夜后，用含有梯度浓度（稀释至0、20、40、80、160、320、640和1280倍）解本10号的新鲜培养基替换原培养基，每个浓度三个复孔。处理24h后，MTT法测定细胞活力。解本10号的抗炎活性根据Liu等人的方法进行。将RAW264.7细胞按照密度为1×105个细胞/孔置于24孔培养板中，培养过夜。用0.5 ml含有不同浓度解本10号的新鲜培养基替换原培养基，每个浓度三个复孔。孵育1h后，每孔加入含LPS的50μL培养基，使LPS的最终浓度为1μg/mL。培养18小时后，将100μL上清液放入另一个96孔板中，然后在540 nm处测量样品的吸光度。用亚硝酸钠标准曲线计算NO含量。NO产生的抑制率按抑制率（%）=100×（COD−SOD）/COD计算。式中，COD为对照组的光密度，SOD为样品的光密度。IC50值定义为亚硝酸盐自由基减少50%的浓度。

　　活性成分分析

　　活性成分由中国食品发酵工业研究院根据相关标准测定。

　　供稿：深圳市疾病预防控制中心；四川大学；南京中医药大学

　　撰写：房师松、许本洪、杨细飞；宋相容、谢永美；刘武昆